影響ELISA實驗的因素和對策

ELISA試驗以靈敏度較高、特異性較好的特點在科研上得到了廣泛的應用，但操作中的各個環(huán)節(jié)對試驗的檢測效果影響較大，如不注意，有可能導致顯色不全、花板等結果。  

下面將操作中各個環(huán)節(jié)常出現問題的原因及解決辦法總結于下：  

選擇試劑：  
選擇質量優(yōu)良的檢測試劑，嚴格按照試劑說明書進行操作，操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。  
參考準備ELISA實驗的正確步驟#ELISA實驗的事前準備工作一  
標本收集與保存：  
避免使用肉眼可見的溶血標本、高脂標本和混濁標本；  
2-8℃下，標本可放置24-48小時，長期保存需放置-20℃下。  
請避免反復凍融。  
具體請參照：  
ELISA實驗標本的采集與處理：  
ELISA實驗標本的保存：  
試劑使用中的準備工作及注意事項：  
試劑盒中會有提示，一般需要準備的有：  
洗滌液；用前配制；有的試劑盒會標明，配好的4度下一般可以放一個月；如果沒有標明，盡量用新鮮的，不要多配制。  
顯色液（有A液和B液的），用前15分鐘配制；  
標準品：有的試劑盒中標準品是已經配制好的，4度保存；有的是要現配制的；按照說明書操作；  
濃縮生物素結合的二抗和HRP：如果需要配制，試劑盒沒注明配好可以保存多久的話，盡量現配現用（用前15分鐘配制）；  
原則是：  
試劑盒上沒有指出配制物的儲藏方式的話，應該現配現用；不要怕麻煩；  
還有，小瓶的管子開蓋前要離心，以免蓋子上粘連以後總量不夠。  
加 樣： 
室溫溫育的試劑，特別是溫育時間比較短的實驗操作的試劑，加樣對數據的影響比較大。特別要注意加樣問題。  
不好的操作原因：  
不會正確使用加樣器；  
血清或血漿標本分離不好即進行加樣；  
手工操作中，加樣板過多造成加樣後放入孵箱前等待時間過長（特別是室內溫度較高時）；  
加完標本再加酶試劑時酶濺出孔外； 
解決辦法：  
熟悉加樣器的使用，在進行實驗之前用水來練習加樣的快速和準確；  
試驗前標本需緩慢升溫至室溫，若標本為血清，凍結血清融解後，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產生氣泡�；鞚峄蛴谐恋淼难�清標本應先離心或過濾，澄清後再檢測；  
加樣時應將所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出；  
加樣後及時放入孵箱；  
加酶試劑後用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干；  
如果采用AT或其他全自動加樣，選擇FAME或其他後處理儀器加酶試劑；  
標本較多時，請分批操作。每次加樣在兩到三分鐘內完成。加標本時三排一加。每次加完樣進行計時；

參考ELISA#加樣  
溫 育：  
不好的操作原因：  
溫育時未貼封片或加蓋，使標本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗徹底；  
溫育時間人為延長，導致非特異性結合緊附于反應孔周圍，難以清洗徹底。  
解決辦法：  
貼封片或加蓋：為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜復蓋板孔，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。  
按說明步驟嚴格控制操作時間。  
建議采用空氣浴進行溫育。  
參考ELISA實驗操作中的溫育（incubation）  
洗 板：  
結果不好的可能原因  
采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉。  
采用半自動洗板機洗板時，洗液量不足，導致洗板不徹底；洗板針堵塞，抽吸不完全；洗板不暢，導致洗板效果差。  
反應板過多造成洗板等待時間長。  
在間接法中如本底較高。 

在ELISA 操作中，洗滌是*主要的關鍵技術，操作時尤為注意：  
保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板後在吸水紙或毛巾（選擇干凈、無或少塵的吸水材料）上輕輕拍干（若使用易掉渣的紙，紙屑會留在板孔中，由于紙屑中含有氧化劑而造成高值陰性。）；  
注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應按要求稀釋，所用的水電導率在1.5us/cm 之下，洗液如果結晶應待其融解後配制。  
保證洗板浸泡時間為40 秒左右，孔內液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內形成氣泡。  
合理安排，或多用幾臺洗板機。  
在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數或延長浸泡時間。  
參考ELISA#洗滌  
顯 色：  
結果不好的可能原因  
顯色劑配制後放置時間過長或使用過期顯色劑；  
加顯色劑時濺出孔外造成液體回流。  
解決方法：  
顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用；  
加樣時保持顯色劑不外流，且加樣量要準確，順序不能顛倒。  
A、B液應避免接觸金屬器械。  
可以參考ELISA#顯色和比色  
終 止：  
結果不好的可能原因：  
加終止液時產生較多氣泡，導致假陽性增加。 

解決方法：  
加終止液時應避免產生氣泡，及時終止顯色。  
讀 板：  
結果不好的可能原因：  
讀板時板底底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面。  
應保證酶標板清潔。  
此外酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀器15-30 分鐘，測讀結果更穩(wěn)定。  
全過程：  
整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸;  
實現ELISA檢測標準自動化，有效提高檢測質量。 

嚴謹的設計，優(yōu)質的試劑，正確的操作和良好的儀器是保證ELISA必要條件。在實際操作中必須嚴格遵照規(guī)定操作，以嚴謹的作風檢測每一份標本，才能保證試驗效果。

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