1.1 操作流程
接種細胞：3×104 /孔 藥物刺激 一般作用24 小時，上機
1.2 方法
在cellquest 環(huán)境下，利用control 細胞標定上樣條件，并在已設(shè)好的文件
夾（INS 文件及SET 文件）下，保存好需要的上樣文件 關(guān)閉cellqest 軟件，
打開MPM 軟件 在MPM 軟件下進行一系列設(shè)定（首先在Autosample 下，
進行SettingInitial 及FinalWashing 操作，清洗整個管路 管路清洗完畢進行
上樣條件設(shè)定（主要設(shè)定上樣體積（一般100ul），混合體積（一般100ul），混合次數(shù)，
清洗次數(shù)等，在Acquisition 菜單下設(shè)定current plate（現(xiàn)在使用的板號是353263），
DateStorageFolder（ 即數(shù)據(jù)儲存文件夾） ， AcquisitionDocument 及
InstrumentSettingsFile（上樣條件從保存好的INS 及SET 文件中選定） 上樣
條件設(shè)定完畢，選定96 孔板的上樣范圍 在Acquisition 下選擇Acquire,
上樣 上樣完畢，退出上樣板，使用次**鈉及水，清洗管路（將次**鈉
及水加在96 孔板上，以上樣的方式清洗管路）
*須知：如果使用PBS 作為上樣鞘液，上樣完畢后，換用水作為鞘液，并反復(fù)沖
洗管路，防止PBS 鹽結(jié)晶堵塞管路。
1.3 注釋
1） 必需的control：應(yīng)準備一管對于檢測指標為陰性的細胞（例如：若要檢測
Jurkat-NF-KB-GFP 經(jīng)藥物刺激樣本，就需要準備一管Jurkat 細胞（GFP 為陰
性）），用于標定機器的上樣條件。細胞量為1×106 個/ml，1ml。
2） 上機前，應(yīng)對樣本進行混合，以使樣本均一（注意使用排槍吹打，勿產(chǎn)生氣泡）。
3） 以上protocol 僅針對于懸浮細胞。
4） 藥物刺激濃度需先做梯度檢測。
第七章 流式細胞分析分選術(shù)
42
2. Cell Cycle Assay
常用的實驗細胞株包括：293（T），MCF7，U2OS，Saos，Hela 等
以U2OS 細胞為例
2.1 細胞培養(yǎng)及鋪板
1） 細胞株及材料：
a） 細胞株： U2OS 細胞
b） 培養(yǎng)基： DMEM（10%FBS，GBICO），DMEM（無血清）
c） 培養(yǎng)器皿：75cm2 培養(yǎng)瓶,6cm 培養(yǎng)皿
2） 細胞培養(yǎng)及鋪板：
a） 傳代：用DMEM（10%FBS） 培養(yǎng)基接種U2OS 至75cm2 培養(yǎng)瓶，細胞長
滿后鋪板并傳代。
注：一般一瓶細胞總數(shù)可以達到1×107 個
b） 鋪板：
細胞消化：將培養(yǎng)好的U2OS 細胞，傾去培養(yǎng)基，加入2ml 1×胰酶輕輕
搖晃以覆蓋整瓶細胞，37℃培養(yǎng)箱放置2-3min，觀察細胞從
瓶壁上脫落下來（也可以用手拍擊瓶壁），顯微鏡下觀測到細胞
成單個，或是只有2-3 個細胞聚團，即可以加入5ml 含有血清
的DMEM（10%FBS），終止胰酶的消化作用。
細胞計數(shù)：如果細胞密度較大，可按一定倍數(shù)稀釋后計數(shù)。
細胞密度（單位：個/ml）=（4 個大方格的細胞總數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)
鋪板： 6cm培養(yǎng)皿按照每孔6×105 個細胞（即1.5×105/ml，4ml）
細胞加入后將6cm 培養(yǎng)皿沿水平面桌面的方向前后左右來回晃動
（手勢一定要輕柔,防止培養(yǎng)液潑出），使細胞能夠均勻分布，放置細
胞培養(yǎng)箱生長。
注：計算鋪板量時，應(yīng)將control 板，藥物陽性對照板及質(zhì)粒對照板考慮在內(nèi)。
第七章 流式細胞分析分選術(shù)
43
2.2 轉(zhuǎn)染
1） 試劑及材料：
a） 轉(zhuǎn)染試劑：Lipofectamin 2000
b） 質(zhì)粒：對照質(zhì)粒：pEF-BOS
p21（陽性對照）
p16（陽性對照）
GFP-spectin
目的基因質(zhì)粒，構(gòu)建在pEF-FN 載體上
注：若目的基因載體不是pEF-FN,則對應(yīng)的空載體要相應(yīng)變化。
2） 轉(zhuǎn)染：細胞密度為50%-60%時，進行轉(zhuǎn)染
A：0.3μg GFP-spectin+3μg interest gene+ serum free DMEM 至終體積500μl/
孔。
B：9.9μL lipofectamine 2000+490.1μL serum free DMEM 體積為500μl /孔，室
溫放置5min
A，B 二者混合，室溫放置20-30min 后將混合液緩慢而均勻的加到6cm 板
細胞液中，每板為1000μL，輕輕搖晃，使DNA 分布均勻，轉(zhuǎn)染5 小時后，
換置培養(yǎng)液（10%FBS+DMEM）。
2.3 細胞分板
細胞分板：轉(zhuǎn)染12-16 小時后, 根據(jù)細胞密度按1：3 或1：2 分板，使分
板后細胞密度為30%左右,37℃繼續(xù)培養(yǎng)30h。
2.4 加藥刺激
除了利用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒作為陽性對照，也可使用藥物處理細胞作為陽性對照樣本
細胞鋪板24 小時后，加藥刺激：
G1，S-arrest ：L-mimosine: 0.5mM
5-fluorourcil: 10mM
G2/M arrest : nocodazole: 50ng/ml
第七章 流式細胞分析分選術(shù)
44
加藥后，繼續(xù)培養(yǎng)24 小時
附注：作為陽性對照的基因及藥物的具體使用情況見附表1。
2.5 細胞收獲及處理
分別收集培養(yǎng)液，在每個6cm 板中加入1ml 胰酶消化（細胞消化的方法同上）。
消化完畢，加入已收集的培養(yǎng)液（注意一一對應(yīng)，防止弄錯）中和胰酶。離心（300g，
5min）收集細胞，棄上清，加入2-3ml 75%乙醇（細胞量較多，可酌量多加），votex，
充分混勻，放入-20oC 冰箱，保存。
2.6 上機樣本制備
從-20oC 取出細胞樣本（至少已在-20oC 放置4 小時），離心（300g，5min）收集細
胞，棄上清。1×PBS 清洗兩遍，加入100ul 1×PBS，votex 混勻，加入10ulPI（終
濃度100ug/ml），10ulRnase（終濃度50ug/ml），置于37oC 水浴鍋，避光處理30min。
注：細胞量較多時，PI 及RNase 量應(yīng)酌量增加。
2.7 上機
在cellquest 環(huán)境下，選擇FL-1（GFP）及FL-3（PI）作為研究對象，先上control
樣本標定上樣條件，進而上其他樣本。
2.8 相關(guān)試劑的配制
1．1×PBS：采用GIBCO 1×10L D’PBS（Cat.No21600-069）配制。
2．PI：以水為溶劑，母液濃度為1mg/ml，配制完畢后，4oC 避光保存
3．Rnase：以水為溶劑，母液濃度為0.5mg/ml，配制完畢后，分裝凍存于-20oC
4．L-mimosine： 以無血清培養(yǎng)液為溶劑，母液濃度為100mM，配制完畢后，
4oC 避光保存
5．5-fluorourcil：以DMSO 為溶劑，母液濃度為549mM，配制完畢后，4oC 保
存
6．Nocodazole：以DMSO 為溶劑，母液濃度為5mg/ml，配制完畢后，4oC 保存
第七章 流式細胞分析分選術(shù)
45
附表1：陽性對照基因及藥物
3.FACS analysis on Apoptosis
可用于凋亡檢測的細胞，多為對細胞凋亡較為敏感的細胞，例如：MCF7, Hela
以Hela 細胞為例
3.1 細胞培養(yǎng)及鋪板
1） 細胞株及材料：
i. 細胞株： Hela 細胞
ii. 培養(yǎng)基： DMEM（10%FBS GBICO），DMEM（無血清）
iii. 培養(yǎng)器皿：75cm2 培養(yǎng)瓶,6cm 培養(yǎng)皿
2） 細胞培養(yǎng)及鋪板：
a） 傳代：用DMEM（10%FBS） 培養(yǎng)基接種hela 細胞至75cm2 培養(yǎng)瓶，細胞
長滿后鋪板并傳代。
注：一般一瓶細胞總數(shù)可以達到3×107 個
b） 鋪板：
i.細胞消化：將培養(yǎng)好的Hela 細胞，傾去培養(yǎng)基，加入2ml 1×胰酶輕
輕搖晃以覆蓋整瓶細胞，37℃培養(yǎng)箱放置2-3min，觀察細
胞從瓶壁上脫落下來（也可以用手拍擊瓶壁），顯微鏡下觀測
基因 藥物
G0/G1 P21,P16 L-mimosine: 0.5mM
S 5-fluorourcil: 10mM
G2/M nocodazole: 50ng/ml
第七章 流式細胞分析分選術(shù)
46
到細胞成單個，或是只有2-3 個細胞聚團，即可以加入5ml
含有血清的DMEM（10%FBS），終止胰酶的消化作用。
ii.細胞計數(shù)：如果細胞密度較大，可按一定倍數(shù)稀釋后計數(shù)。
細胞密度（單位：個/ml）=（4 個大方格的細胞總數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)
iii.鋪板： 6cm 培養(yǎng)皿按照每孔3×105 個細胞（即0.75×105/ml，4ml）接種，
細胞加入后將6cm 板沿水平面桌面的方向前后左右來回晃動（手勢一定
要輕柔,防止培養(yǎng)液潑出），使細胞能夠均勻分布，放置細胞培養(yǎng)箱生長。
注：計算鋪板量時，應(yīng)將control 板，藥物陽性對照板及質(zhì)粒對照板考慮在內(nèi)。
3.2 轉(zhuǎn)染
1）試劑及材料：
轉(zhuǎn)染試劑：Lipofectamin 2000
質(zhì)粒： a:對照質(zhì)粒：pEF-BOS
RIP（陽性對照）
b:GFP-spectin
c:目的基因質(zhì)粒，構(gòu)建在pEF-FN 載體上
注：若目的基因載體不是pEF-FN,則對應(yīng)的空載體要相應(yīng)變化。
2）轉(zhuǎn)染：細胞密度為50%-60%時，進行轉(zhuǎn)染
A：0.15μg GFP-spectin+3μg interest gene+ serum free DMEM 至終體積500μl/孔。
B：9.45μL lipofectamine 2000+490.55μL serum free DMEM 體積為500μl /孔，室
溫放置5min
A， B 二者混合，室溫放置20-30min 后將混合液緩慢而均勻的加到6cm 培養(yǎng)皿
中，每孔為1000μL，輕輕搖晃，使DNA 分布均勻，轉(zhuǎn)染5 小時后,換置培養(yǎng)
液（10%FBS+DMEM）。繼續(xù)培養(yǎng)
3.3 細胞收獲
第七章 流式細胞分析分選術(shù)
47
轉(zhuǎn)染24 小時后，一旦觀察到經(jīng)RIP 轉(zhuǎn)染的細胞明顯死亡，即可收獲細胞。
每板分別收集培養(yǎng)液，在每個6cm 板中加入1ml 胰酶（細胞消化的方法同上），
消化完畢，加入已收集的培養(yǎng)液（注意一一對應(yīng)，防止弄錯）中和胰酶，離心（300g，
5min）收集細胞。
3.4 上機樣本制備
收集細胞液（包括上清） 同時準備56℃水浴處理細胞
分別取一點
沒有轉(zhuǎn)染的細胞
作為control
及轉(zhuǎn)染的細胞
作為GFP 單染樣本 PBS 洗
染AnnexinV Ab-PE 染7-AAD
室溫避光15min
PE-mouse IgG 室溫避光染色15min
1╳binding buffer 洗兩次
染7-AAD，室溫避光15min AnnexinV Ab-PE/ 7-AAD 染色，室溫避光15min
3.5 上機
在cellquest 環(huán)境下，選擇FL-1（GFP），F(xiàn)L-2（PE）及FL-3（7-AAD）作為研究對
象，先上control 樣本標定電壓，域值，再用單染GFP 的細胞樣本及水浴處理后
單染PE,7-AAD 的樣本，調(diào)節(jié)補償，*終確立上樣條件，進而上其他樣本。
注：A:用GFP 單染樣本以及水浴處理的單標Annexin V-PE 樣本調(diào)節(jié)FL1-H 及
FL2-H 的補償；
B:水浴處理的單標Annexin V-PE 以及水浴處理的單標7-AAD 樣本調(diào)節(jié)
FL2-H 及FL3-H 的補償。
4. CD69 檢測
第七章 流式細胞分析分選術(shù)
48
（或其他類似的免疫熒光檢測）
4.1 細胞培養(yǎng)
1）細胞株及材料：
細胞株：Jurkat-T 細胞或Jurkat 細胞
培養(yǎng)基：RPMI 1640（10%FBS GBICO；1%雙抗），RPMI 1640（無血清）
培養(yǎng)器皿：75cm2 培養(yǎng)瓶;175cm2 培養(yǎng)瓶;25 cm2 培養(yǎng)瓶;96 孔細胞培養(yǎng)板
2）Jurkat-T 細胞的培養(yǎng)：
Jurkat-T 細胞為懸浮細胞，細胞活力好時，鏡檢多為10 個左右細胞聚團，
及少量游離的單個細胞，細胞圓而透亮。一般培養(yǎng)按密度來計算，起始培養(yǎng)
密度不要低于1×105 個/ml，24hr 后細胞密度即可達到2×105 個/ml，以此類推
在第五天上即可以達到1.6×106 個/ml，根據(jù)這個來調(diào)整接種密度及傳代天數(shù)。
細胞的密度高不能超過1.6×106 個/ml。
例如，起始培養(yǎng)密度2×105 個/ml，體積30 ml，在第三天時, 細胞密度
達到8×105 個/ml，細胞總數(shù)達到2.4×107 個，因為檢測一個待檢基因的電擊
所需細胞數(shù)量為1×107 個，所以，此培養(yǎng)的細胞數(shù)只能做2.4 個樣品，因此，
根據(jù)實驗所需要檢測的樣品數(shù)目來調(diào)整培養(yǎng)細胞的體積（象175cm2 的培養(yǎng)瓶
可以培養(yǎng)200-300ml 細胞懸液，細胞總數(shù)可以達到16-24×107，這樣就可以做
16-24 個樣品）。
4.2 電擊轉(zhuǎn)化
細胞總數(shù)達到檢測樣品所需則可轉(zhuǎn)染（細胞密度在1×106/ml 左右）。
轉(zhuǎn)染用品：電擊儀，400mm 電擊杯
質(zhì)粒： a:對照質(zhì)粒：NFAT 刺激系統(tǒng)：negative control:pEF-BOS
positive control: SYC plasmid
NFAT 抑制系統(tǒng): negative control:pEF-BOS
positive control: SLIM plasmid
b: NFAT-luc report plasmid
c:目的基因質(zhì)粒，構(gòu)建在pEF-FN 載體上
試劑： 臺盼藍（0.4%）
1）將Jurkat-T 細胞轉(zhuǎn)到50ml 離心管中，細胞計數(shù)（細胞密度在1×106 左右）。
第七章 流式細胞分析分選術(shù)
49
2）1000rpm離心，用無血清的RPMI1640 培養(yǎng)液收集細胞，調(diào)整濃度為2.5×107/mL,
每個電極杯中加入400μl 細胞液（細胞總數(shù)為1×107 個）。
3）依次加入10μg NFAT-luc reporter gene 和20ug interest gene（體積控制在20μl 以
內(nèi)），使質(zhì)粒和細胞混勻（盡量不要產(chǎn)生氣泡）。
4）電擊條件250V，950μF。電擊前輕輕彈擊電擊杯，將杯底的細胞重懸起來，注
意不要產(chǎn)生氣泡。電擊時觀察一下time constant（約為24ms）。
5）電擊完后立即彈擊電擊杯的側(cè)壁使細胞混勻，室溫下放置30min。
6）將電極杯中的細胞加到10mL RPMI1640 培養(yǎng)液中（含serum）24cm2 培養(yǎng)瓶，培
養(yǎng)40hr（即培養(yǎng)到第三天上午）。
4.3 鋪板，加藥
C305：1∶60 稀釋使用
PMA: 儲存濃度為0.5mg/ml，應(yīng)用濃度為50ng/ml（稀釋10000 倍））
Ionomycin: 儲存濃度為1mM，應(yīng)用濃度為1μM（稀釋1000 倍））；
1）將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)40hr 后的細胞轉(zhuǎn)到15ml 離心管中，進行活細胞計數(shù)（臺盼藍染色），
離心收細胞，調(diào)整細胞濃度為2×106/ml。
2）在96 孔板中，每孔加50μL 細胞（細胞數(shù)為1×105），每個樣品還是要做3 個復(fù)
孔。NFAT 刺激系統(tǒng)，NFAT 抑制系統(tǒng)可以同時進行，前者無需加藥刺激，后
者需要做C305 抗體刺激和PMA+ Ionomycin 刺激，因此，一個樣品需要做9
個復(fù)孔。按順序在96 孔板中加入細胞，并相應(yīng)做好標記。
3） 對于NFAT 刺激系統(tǒng)，直接在每孔中補加50μl 新鮮培養(yǎng)基，使終體積為100μl；
對于NFAT 抑制系統(tǒng)分別加入50μL C305（anti-TCR, 60 倍稀釋）；或50μl
PMA（50ng/mL）+Ionomycin（1μM），刺激8-12 小時。
4.4 細胞收獲及處理
將刺激8-12 小時后的細胞取出，離心收集細胞
4.5 樣本制備
第七章 流式細胞分析分選術(shù)
50
A:CD69 間標法
Cells harvested
1 × PBS 清洗兩遍
Cells were suspended in 1ml 1×binding buffer （1% BSA）
（cell 濃度約1×106/ml）
取其中的100μl
5μl pure-Mouse IgG1 5μl Mouse anti-human CD69 （或其它一抗）
（非特異性染色）
4oC 或冰上放置， 30min
1×binding buffer （1% BSA） 清洗兩遍（每次4ml）
5μl PE goat anti-mouse IgG 及 5μl 7-AAD
4oC 或冰上，避光放置15min
1×PBS 清洗兩遍（每次2ml）
上機
B:CD69 檢測直標法
操作步驟基本同間標法，只是作非特意性對照的樣本，直接用Mouse
anti-human IgG-pe 直接標記
4.6 上機
第七章 流式細胞分析分選術(shù)
51
在cellquest 環(huán)境下，選擇FL-1（GFP），F(xiàn)L-2（PE）及FL-3（7-AAD）作為研究對
象，先上control 樣本標定電壓，閾值，并調(diào)節(jié)補償，*終確立上樣條件，進而
上其他樣本。
4.7 幾種藥物的儲存濃度和應(yīng)用濃度
TNF 1×106U/瓶 1mg=4×107U, 1×106U=25μg 溶于12.5mL PBS 中，濃度為
2μg/mL。
儲存濃度：2μg/mL
應(yīng)用濃度：20ng/mL（稀釋100 倍）
C305 60 倍稀釋使用。
PMA ａnd Ionomycin（dissolved in DMSO）
PMA:1 支1mg 溶于2ml DMSO 即0.5mg/mL（儲存于-80°C）
儲存濃度：0.5mg/ml
應(yīng)用濃度：50ng/ml（稀釋10000 倍）
Ionomycin: 1mg/747.1（MW）=1.33×10-3mmol 溶于1.33ml,濃度為1mM。（儲存與
-80°C）
儲存濃度：1mM
應(yīng)用濃度：1μM（稀釋1000 倍）
5. 細胞分選
5.1 分選細胞樣本處理
第七章 流式細胞分析分選術(shù)
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貼壁細胞培養(yǎng)：一個細胞樣本 懸浮細胞培養(yǎng)：一個細胞樣本
至少需要一個10cm 細胞板 細胞總數(shù)應(yīng)大于1×107
（細胞總數(shù)大于1×107 ）
收集細胞
去除培養(yǎng)液
胰酶消化（一般加入2ml 胰酶，
37 oC 充分消化，大約3 分鐘,
消化至細胞輕拍脫壁）
加入5ml 培養(yǎng)液中和，充分
分散細胞（盡量使之呈單
細胞懸液,可通過顯微鏡觀察判斷）
取100ul 細胞上機，測定轉(zhuǎn)染效率，剩余細胞記數(shù)，離心
根據(jù)轉(zhuǎn)染效率，分選模式（一般選用exclusion 模式），調(diào)節(jié)細胞濃度，達到
上樣速率1000-3000 個/秒，目的細胞300 個/秒（細胞濃度（個/ul）=300/目的
細胞百分率）
上機，分選
分選后細胞，1500 轉(zhuǎn)/秒，5min,離心收集細胞
1） 若所要分選的是懸浮細胞，要求細胞總數(shù)大于1×107，直接收集細胞液
2） 必需的control：舉例說明，如果需要篩選的是GFP 陽性的細胞，必須提供沒
有轉(zhuǎn)染的同種細胞。
3） 如果分選后的細胞還需要繼續(xù)培養(yǎng)，需要預(yù)先用無菌的4%BSA 包埋收集管
（在無菌收集管中，加滿4%BSA ，并放置于4℃至少1 小時，使用前倒除包
埋液）。
4） 如果分選后的細胞還需要繼續(xù)培養(yǎng)，所有用到的試劑，包括鞘液，都必須無
菌處理；在分選前及分選過程中，必須進行嚴格無菌操作，機器需要經(jīng)過酒
精沖洗，無菌PBS 沖洗的過程。
5.2 分選細胞的上機操作程序
5.2.1 上機分選前準備
第七章 流式細胞分析分選術(shù)
53
1）無菌分選
分選前夜FACS 儀器間需紫外照射過夜，收集管預(yù)先用4%BSA 包埋（4
℃至少1 小時） 分選前沖洗機器程序：1. 將上樣管換成75%酒精，鞘液
桶中換成3L 75%酒精沖洗，至3L 酒精完全跑完； 2. 倒去鞘液桶中殘余的酒精，
用無菌PBS 沖洗鞘液桶使酒精徹底去除，加無菌PBS 至鞘液桶滿，同時上樣管
中換成無菌PBS，沖洗，使每個收集管收集液體約20ml 左右,即可上機分選。
2）非無菌分選
如果不需要無菌分選，可僅用少量酒精沖洗，再用PBS 沖洗至每管收集約
20ml 后即可上機分選。
5.2.2 上機分選步驟
打開cellquest 軟件，先上control 樣本，確定細胞獲取條件，并劃定需要獲
取的細胞范圍；在Acquire menu 菜單下，選擇SortSetup，并設(shè)定SortSetup 下的
一系列參數(shù)，設(shè)定完畢，Acquire,上樣分選。
注：SortSetup 下主要的參數(shù)設(shè)定如下：
SortGate 選擇分選門，SortCount 選擇0（連續(xù)分選），
SortMode 選擇分選模式（一般使用exclusion）
*須知：分選完畢后，用水沖洗，使每個收集管收集液體約20ml 左右后可停止（防
止分選管道中形成鹽結(jié)晶）。繼而用常規(guī)沖洗方法沖洗上樣管。
5.3 相關(guān)試劑的配制
1．4%BSA 溶液:使用1×PBS 作為溶劑,每100ml 1×PBS 中加入4gBSA,充分溶
解.
2．1×PBS 溶液:采用GIBCO 1×10L D’PBS（Cat.No21600-069）配制。                                                                                                                                                                                                           上海恒遠生物科技有限公司提供各種進口高端產(chǎn)品，提供免費代測服務(wù)，歡迎新老顧客咨詢。