小動物學習記憶行為檢測技術(shù)

               －－－－避暗法                          

一、實驗目的

1、學習小白鼠學習記憶行為檢測方法

   2、學習小鼠避暗自動測試儀的使用方法。

   3. 了解影響學習記憶功能的一些因素。

二、實驗原理

    嚙齒類動物系夜行性動物，喜歡黑暗的地方，而回避光亮之地。它將設(shè)法逃向暗處，此時在暗處給予其電刺激，小鼠會被迫逃回明亮處，并獲得記憶。根據(jù)此原理設(shè)計的實驗為一次性被動回避反應實驗。

被動回避反應（Passive Avoidance Response）為二十世紀60年代后期發(fā)展起來的、普遍用于檢測小動物學習記憶能力的一種動物模型。反應特征：動物必須學會躲避可怕的事件，而抑制其天然本性。被動回避反應有：避暗法（又稱步入法step-through test）、跳臺法（又稱步下法step-down test）等。

三、實驗器材

小白鼠 常用手術(shù)器械、亞**鈉、東莨菪堿（scopolamine，Scop.）、生理鹽水、35 %酒精。

四、實驗步驟 

1. 實驗儀器

小鼠避暗自動測試儀由控制器和活動箱兩部分組成，可同時對6只小鼠進行實驗。明暗實驗箱之間有一小門供動物進出，當動物進入暗室被電擊時，它可自動記錄小鼠次從明室進入暗室的潛伏期和受到電擊的次數(shù)，還可通過按鍵靈活地選擇刺激電壓和設(shè)置實驗時間。

2. 實驗程序：

2.1適應：將動物頭朝室壁放入明室，兩室之間的門洞敞開，讓動物在兩室內(nèi)自由活動2-3分鐘，取出后放回飼養(yǎng)籠。

2.2訓練：第二天, 將動物放入明室, 它很快鉆入暗室, 連接兩室的門洞關(guān)閉，同時啟動電刺激器, 動物足部受電擊。如果動物在次訓練時超過100秒不進暗室, 淘汰之或用手把它輕輕趕進暗室。

記錄指標：

（1）記錄動物自明室進入暗室的潛伏期，可作為判斷給藥后動物行為是否有變的一個指標。若藥物致使動物鎮(zhèn)靜，則潛伏期顯著長于對照組。

（2）記錄動物受到電擊后的反應，如劇烈嘶叫并跳躍，評為A級反應；微弱尖叫，評為B級反應；不叫，評為C級反應。受到電擊后動物一般均跳躍。C級反應常伴動物跳躍，動物雖不尖叫，但正常動物均能感受電擊疼痛，顯示好的記憶成績。C級反應多見于雄性動物。A級反應多見于雌性動物。該記錄可作為動物痛域是否變化的一個輔助觀察指標。

2.3重測試：訓練后24小時（第三天），再次將動物放入明室，進行重測試。

記錄指標：

（1）記錄動物進入暗室的潛伏期，為步入潛伏期（step through latency, STL）。潛伏期設(shè)為300秒。

（2）記錄動物300秒內(nèi)進入暗室的錯誤次數(shù)，包括次錯誤進入暗室的次數(shù)。

實驗設(shè)計舉例

按照信息論將記憶簡單劃分為：記憶的獲得（也即學習過程、信息的獲得過程）、記憶的鞏固（信息的保持過程）、記憶的再現(xiàn)（信息的提取過程）時，我們可依此來篩選作用于記憶不同階段的認知藥物。

在訓練前、后或重測前給損傷動物記憶的藥物，可分別觀察該藥物對記憶不同階段的影響，在此之前給動物待檢測認知藥物，即可依據(jù)實驗結(jié)果判斷該認知藥物對抗損傷藥物的效果。為簡化篩選工作，常選用實驗步驟較少的小動物學習記憶測試方法，現(xiàn)以步入法為例說明如下。原理如圖示。

適應 ———— 訓練（電擊）——— （24小時后）——— 重測（不電擊）

       影響           影響                    影響

        記憶獲得       記憶鞏固                記憶再現(xiàn)

一、記憶獲得過程

1. 建立記憶獲得障礙模型：

在動物進行電擊訓練之前15-20分鐘，給動物腹腔注射氫溴酸東莨菪堿（膽堿能M受體拮抗劑，HBr-Scopalamine），小鼠：3mg/kg，可見給藥組動物出現(xiàn)探究行為，訓練時在明室內(nèi)駐留時間略長于對照組，進入暗室后受到電刺激時的反應與對照組相似：嘶叫或跳躍。24小時后當再次將動物放入明室時，動物進入暗室的潛伏期顯著低于對照組，即制備成功記憶障礙模型。

2. 待測藥物的服用：

根據(jù)待檢測藥物在動物體內(nèi)的作用高峰時間，于相應時間給動物服藥，如口服藥物，可于訓練前1小時給動物灌服待檢測藥物，然后再于訓練前15-20分鐘給動物損傷記憶獲得的藥物，如氫溴酸東莨菪堿等。

二、記憶鞏固過程

1. 建立記憶鞏固障礙模型：

動物電擊訓練結(jié)束后立即給動物腹腔注射蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（Cycloheximide，小鼠：90-100mg/kg）抑制蛋白質(zhì)合成，或皮下注射NaNO2（小鼠：120mg/kg）導致動物短暫性缺氧，或給動物施行頭部瞬間電休克。然后放回飼養(yǎng)盒內(nèi)，24小時后重測試。

2. 待測藥物的服用：

若是口服藥物，于電擊訓練前藥物作用高峰期（一般選1小時前）給動物灌服藥物。若是腹腔注射藥物，一般于訓練前半小時注射。然后給動物電擊訓練，訓練后立即給損傷記憶鞏固藥物或其它實驗因素，24小時后重測試，可檢測認知藥物對記憶鞏固障礙的對抗作用。

三、記憶再現(xiàn)過程

1. 建立記憶再現(xiàn)障礙模型

于動物重測試之前15分鐘給小鼠灌服酒精（35%，0.1ml/10g鼠重），15分鐘后進行重測試�？梢娦∈笥洃浱崛∵^程受到損傷。

2. 待測藥物的服用：于動物重測試之前1小時給動物口服待檢藥物。

注意：

該損傷只有在重測前10-30分鐘灌胃酒精才起作用, 時間長于30分鐘則無效。

該劑量酒精只對較不鞏固、一次性記憶有損傷作用，而對小鼠需經(jīng)多次訓練而獲得的較鞏固的記憶的再現(xiàn)無影響。

附： 步下法（step-down test），又稱跳臺法 

實驗原理：

依據(jù)動物的習性，嚙齒類動物在空曠的場地內(nèi)，大多時間會逗留于墻邊或角落。而被放在高臺上時，便會依本能迅速跳下，躲避在墻邊或墻角。跳臺儀的底部可以通電，上面放置一個絕緣的跳臺。動物在訓練時受到電擊，跳上跳臺以躲避電擊，從而獲得記憶。動物的記憶力下降時，表現(xiàn)為次從跳臺跳下的潛伏期縮短，跳下的次數(shù)增加。動物的記憶力增強時則跳下的潛伏期延長，觸電次數(shù)明顯減少。 

實驗程序

1. 適應：將動物放上平臺，使動物在箱內(nèi)自由上下適應2-3分鐘，然后將動物放回飼養(yǎng)盒�；蛎看芜m應10秒，共適應3次，間隔30分鐘。后者使動物較前者更能充分適應實驗者的手勢和整個實驗過程。

2. 訓練：可在適應之后立即進行，也可在適應后24小時進行。

將動物再次放上平臺, 同時開啟電刺激器, 箱底銅柵供電。動物由于在箱內(nèi)適應過，幾乎馬上跳下平臺，四肢于是立即遭到電擊。由于電擊的疼痛，動物上下跳躍，偶爾于無意之中跳回平臺，旋即又跳下平臺，如此反復多次。

記錄指標：

1）動物從放上平臺至跳下平臺的潛伏期；

2）動物反復下臺的錯誤次數(shù), 可代表動物的學習成績；

3. 重測試：

訓練后24小時重測試, 再次將動物放上平臺，觀察動物下臺情況。

記錄指標：

動物自放上平臺后至跳下平臺的潛伏期、5 分鐘內(nèi)跳下平臺的錯誤次數(shù), 此為動物的記憶成績。