實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 取50~100mg的組織,加入1 ml Trizol試劑，用勻漿器打勻（Trizol 先放于冰上）。

2. 將勻漿室溫放置5 min。

3. 加入200 μl 氯仿,劇烈震蕩混勻30s，冰上靜置3min。

4. 12000 rpm，4℃ 離心15 min。

5. 將上清液小心轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml離心管中（取400μl ），加入等量體積的異丙醇，上下顛倒幾次混勻，室溫下放置15 min。（此步中注意：不要吸取任何中間層物質(zhì)，寧缺勿爛。）

6. 12000 rpm， 4℃ 離心15 min 。

7. 小心移去上清液，防止rna沉淀丟失。

8. 用70%乙醇（DEPC處理的水配制）洗滌1次，加入700 μl乙醇，將RNA沉淀彈起，漂洗。（此時(shí)RNA是不溶解的）

9. 8000 rpm，室溫離心10min。

10. 盡可能徹底地吸走上清，防止RNA沉淀丟失。

11. 真空離心干燥3~5分鐘，或放在室溫下使乙醇完全揮發(fā)掉。

12. 沉淀用30 μl DEPC-H2O溶解。如發(fā)現(xiàn)沉淀難溶，68 ℃處理10 min。

13. RNA檢測(cè)

（1）測(cè)定樣品在260 nm和280 nm的吸光值按1OD=40 μg/ ml RNA計(jì)算RNA的產(chǎn)量。OD260/OD280在1.8-2.0 。

（2）進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳,確定RNA的完整性和污染情況。

常見失敗原因：

1、低得率

A.樣品裂解或勻漿處理不徹底

B.*后得到的RNA沉淀未完全溶解

2、A260/A280<1.65

A.檢測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品不是溶于TE，而

是溶于水。低離子濃度和低pH條件下，A280

值會(huì)較高。

B.樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少。

C.勻漿后樣品未在室溫放置5分鐘。

D.水相中混有有機(jī)相。

E.*后得到的RNA沉淀未完全溶解。

3、RNA降解

A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍

B.樣品或提取的RNA沉淀保存于-5－－20℃，

未在-60－－70℃保存。

C.細(xì)胞在胰酶處理時(shí)被破壞。

D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理。

原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司