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ELISA實驗常見問題分析

點擊次數(shù)：13354 發(fā)布時間：2012/11/12 17:47:03

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ELISA實驗常見問題分析

異常	結果描述	原因分析	對策
白板	顯色步驟結束后，酶標板所有孔均無顏色。陽性對照不顯色。	試劑已過效期，或不同試劑盒組分混用	檢查試劑的組分及批號，確認未過期以及所有組分均屬對應的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。
		錯加、漏加試劑底物、顯色劑 A或B	嚴格按說明書的步驟操作，加完試劑后可觀察一下液面高度是否一致，以減少漏加現(xiàn)象。
		洗板及加樣過程中，酶標受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力	確認盛酶標的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認配制洗液的容器已洗干凈。
		終止液誤作洗滌液稀釋或當?shù)孜锞彌_液配制	每次配制時都應看清標簽標明物質
		蒸餾水有問題	確認配制洗液的純化水達到要求且未污染，與好蒸餾水比較。
顯色弱、靈敏度低	實驗結束后，包括陽性對照、質控在內的所有板孔顏色均較淡。	試劑盒超過期，超過有效期的產品可能會產生很弱的信號；試劑盒沒有按規(guī)定進行保存，受高溫影響；	實驗前檢查試劑的組分及批號，確認試劑未過期。不要將試劑盒長時間置于常溫下，按使用規(guī)定儲藏。
		試劑、樣品用前未平衡至室溫	從低溫冰箱中取出的試劑及樣品應置室溫平衡 20分鐘左右。
		加入試劑的體積和時間有誤，移液器計量不準，吸嘴內水分太多或不清潔；	確定所使用的試劑體積正確，加入時間適當。校正移液器，移液器與吸嘴配合要緊密吻合。移液不宜太快，排放應完全。
		洗板及加樣過程中，酶標受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力	確認盛酶標的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認配制洗液的容器已洗干凈，確認配制洗液的純化水達到要求且未受污染。
		孵育時間及孵育溫度未達到要求，反應板放入培養(yǎng)箱時注意溫度并及時調整。	孵育溫度應控制在 37-38℃，孵育時間嚴格按照說明書操作。保溫期內不宜多開門，以免影響保溫。
		洗板次數(shù)過多，或濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求；洗滌沖擊力太大。浸泡時間太長；	嚴格按說明書要求稀釋濃縮洗液及洗板，減小洗滌沖擊力，按說明書要求置留洗滌液時間和洗滌次數(shù)。
		顯色劑加量不足或順序顛倒，或混合后加入；	顯色劑滴瓶垂直向下，持力均勻，滴速不宜過快，先加顯色劑 A，后加顯色劑B，不可將A、B液混合后加入
		底物作用時間不夠；	準確定時。
		蒸餾水水質有問題；	測定蒸餾水配制試劑對酶免疫法的影響。
	實驗結束后，陰陽性對照正常，質控正常，但臨床標本感覺顯色較弱	待測標本中可能不含強陽性標本，故結果可能是正常的	如有懷疑，可復檢
	實驗結束后，陰陽性對照正常，質控正常，但臨床標本感覺顯色較弱	標本加入疊氮鈉作為防腐劑	酶免實驗中的標本禁用疊氮鈉作為防腐劑，可選用 proclin、硫柳汞等其他防腐劑
	陰陽性對照正常，但質控、參考品或個別弱陽性標本未能檢出。	未達要求的孵育溫度及孵育時間可檢出強陽性標本，但質控或弱陽性標本受溫度變化影響較大而被未檢出	質控品或標本避免反復凍融。標本在一周內使用的，可存于 2-8℃，如需長期保存，應置于-20℃以下保存。質控品應小量分裝，并置于-20℃以下保存。
		質控品或標本高溫放置過久，或被反復凍融致待測物滴度下降，而未能檢出	重新設定酶標儀的參數(shù)，特別是檢查濾光片是否匹配。
		儀器設定不正確，濾光片不匹配	重新設定酶標儀的參數(shù)，特別是檢查濾光片是否匹配
靈敏度過高、板底高、高背景	終止后，整板結果顯現(xiàn)均一的黃色或淡黃色；或陰陽性對照、質控正常，標本陰性標本 OD值過高。	整板的黃板現(xiàn)象可能是由于錯加其他試劑造成，如同時操作兩對半試劑時，測 HbsAb板用于測HBsAg等；	實驗前檢查試劑的組分及批號，確認所有組分均屬于對應的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用
		酶標對吸頭的污染以及對盛放顯色劑容器的污染都易造成黃板現(xiàn)象；	避免試劑組分間的交叉污染，確保吸頭、容器的干凈
		顯色劑在光照條件下放置過久，實驗前已變藍	顯色劑 A、B未使用前避光保存
		孵育溫度過高或孵育時間過長；	孵育溫度應控制在 37-38℃，孵育時間嚴格按照說明書操作。
		未按要求洗板。特別是洗滌時每孔未注滿洗液，易造成花板黃板現(xiàn)象	嚴格按說明書要求洗板
		花板，一般是由于臨床標本的收集、處理和保存方法不當造成	放置時間（自然放置 1~2h）及離心轉速（3000r/min）、離心時間（15min）應引起注意。
	出現(xiàn)隨機性的花板、跳孔現(xiàn)象	樣品離心不完全，反應孔內發(fā)生凝血或殘留細胞成分；	充分離心， 3000rpm6分鐘以上。
		加樣時交叉污染；	加標本時盡量避免交叉污染。如盛標本的試管周圍常有血痂，易脫落，應遠離酶標板。
		手工洗板造成的交叉污染	手工洗板時前 3次注洗液后應立即棄去，后幾次再設定浸泡時間，可減少交叉污染
		洗板機加液頭堵塞導致加液不滿或吸液殘留量較大，造成花板、跳孔	疏通加液頭，使洗板時每孔均注滿洗液，吸液時殘留量要小。
		拍板時交叉污染	洗板完畢拍板時用合適的吸水紙巾，不要把無關物質拍進板孔，并盡量不要在同位置拍，以免交叉污染。
假陽性	假陽性現(xiàn)象是一個綜合現(xiàn)象，可參考上文 “靈敏度過高、板底高、高背景” 中的分析。這里只列舉常見的原因及對策。	計算 Cutoff值時使用的公式不正確，導致計算得出的CutOff值過低，從而導致出現(xiàn)假陽性	CutOff值計算公式應嚴格參照所屬產品的說明書，應注意各個酶免產品的Cutoff值計算公式不盡相同
		洗板時未能注滿洗液或洗板次數(shù)、浸泡時間不夠，洗滌不充分，樣品中有其他成分殘留導致花板、跳孔，假陽性增多	嚴格按說明書要求洗板。調整洗板機時，應注意有時儀器標示的液量與實際液量并不相符，應根據(jù)實際情況調整至每孔注滿。
		血清標本處理不當，如未除去細胞成分、纖維蛋白原及其它干擾物可出現(xiàn)孔底由變藍的跳孔現(xiàn)象，此標本重復實驗結果往往是陰性；	放置時間（自然放置 1~2h）及離心轉速（3000r/min）、離心時間（15min）應引起注意
		廠家試劑質量的變化造成	國家標準要求提高靈敏度時，廠家試劑靈敏度也相應提高，假陽率常常有所上升，但只要在合理范圍，是可以接受的
		水質問題	防止蒸餾水污染
		加酶量過多（如 50uL誤認為100uL）或丙肝酶稀釋時加量過多	加酶前檢查移液器調節(jié)量是否準確，稀釋酶時思想要集中
		培養(yǎng)箱溫度超過 37℃或酶結合物反應時間或底物顯色時間超過	放入板以前要檢查培養(yǎng)箱的溫度，準確定時
		底物配制時間過長、或底物污染	底物應在酶反應完畢即將洗滌前 5分鐘配制，注意避光
		該批樣品放置時間過長，樣品污染	樣品應保持新鮮，或低溫保存，防止污染
		移液嘴重復使用，未洗凈或消毒不完全而用于加酶或底物	移液嘴盡可能一次性使用
重復性差		1、樣品數(shù)量不一，加樣時間長短不一	重復某一樣品時，加樣時間盡可能與次接近
		2、樣品加入后未混勻	加樣后在混勻器上充分混勻
		3、酶標儀濾光片不對或輸入波長不對	TMB顯色用450/630波長
		4、酶標儀測定重復性差	校對酶標儀
		5、洗滌不正確	洗滌液注滿各孔但不要溢出。洗板時反應板面向下，垂直用力甩凈內容物（可多甩幾次），在干凈、無或少塵的吸水材料上拍干。洗板機洗板時不應有堵孔，洗滌應充分
		6、溫育條件不一致（一次用水育，一次用恒溫箱）	恒溫箱溫育較水浴顯色深， OD值高出0.1-0.15,均采用恒溫箱.如用水浴水溫應控制在37℃
		7、不慎多加或少加酶或顯色劑	多加時顯色深，少加則淺，用記號筆圈上，便于分析
		8、閾值附近時陰時陽	同一樣品做三個復孔，以二個（含二個以上相同結果為準）
		9、加樣量不足、保溫時間、洗滌條件一致	盡可能使用同一移液器和裝緊吸嘴重復測定標本。條件、人員等應盡量與上次保持一致